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棉花品种真实性鉴定SSR分子标记法
鉴定依据 NY/T 2634-2022《棉花品种真实性鉴定 SSR分子标记法》... 更多↓
机构信息
NY/T 2634-2022 《棉花品种真实性鉴定 SSR分子标记法》
NY/T 2634-2022《棉花品种真实性鉴定 SSR分子标记法》是由中华人民共和国农业农村部发布的农业行业标准，自2023年3月1日起实施，替代了2014年的旧版标准。该标准规定了利用简单重复序列(SSR)分子标记法进行棉花品种真实性检测的技术规范，包括术语定义、检测原理、操作程序、结果判定等内容。以下将从标准概述、技术内容、应用范围、创新特点等多个方面对该标准进行全面解析。
标准概述与背景
NY/T 2634-2022《棉花品种真实性鉴定 SSR分子标记法》是我国棉花品种鉴定领域的重要技术标准，由农业农村部种业管理司提出并归口，全国农业技术推广服务中心、中国农业科学院棉花研究所和安徽省农业科学院等单位共同起草完成。该标准于2022年11月11日发布，2023年3月1日正式实施，取代了2014年的旧版标准。
标准制定的背景与意义
棉花作为我国重要的经济作物，其品种真实性和纯度直接关系到棉花产业的健康发展。然而，棉花是一种异源四倍体作物，基因组结构复杂，且属于常异花授粉作物，导致品种难以实现高度纯合。此外，生产上品种类型复杂多样，遗传背景狭窄，这些因素使得棉花育成品种准确判别难度大，棉种市场长期缺乏有效的监管技术手段，品种多乱杂现象长期存在，严重影响纤维品质一致性。
为解决这一问题，农业农村部组织相关科研单位开展了棉花品种真实性鉴定技术研究，基于棉花基因组学最新研究进展，结合棉花的特殊性，开发了一套高质量的SSR标记组合，建立了高效的分子检测技术体系，形成了NY/T 2634-2022标准。
标准的主要特点
与2014版标准相比，NY/T 2634-2022在技术内容和结构上有多项重要改进：
调整了"范围"章节，明确了适用对象和限制条件
增加了"缩略语"章节，统一了技术术语
优化了"原理"和"检测方案"章节，使技术路线更加清晰
扩充了"仪器设备、试剂和溶液配制"内容，提高了可操作性
增加了"鉴定意见"和"结果报告"章节，规范了结果判定和报告格式
更新了附录内容，包括溶液配制、等位变异信息、引物分组方案和参照样品名单79
这些改进使新标准更加科学、实用，能够更好地满足棉花品种真实性鉴定的实际需求。
标准适用范围与术语定义
NY/T 2634-2022标准明确规定了其适用范围和限制条件，并定义了相关专业术语，为棉花品种真实性鉴定提供了统一的技术语言和判定依据。
适用范围
该标准适用于陆地棉(G. hirsutum)和海岛棉(G. barbadense)两大栽培棉种的品种真实性验证和品种真实性身份鉴定。具体包括以下两种应用场景：
品种真实性验证：通过与对应品种名称的标准样品比较，检测证实供检样品品种名称与标注是否相符。这种应用主要针对已知品种的确认性检测。
品种真实性身份鉴定：通过与标准样品DNA指纹数据库比对或筛查，确定送验样品的真实品种名称。这种应用适用于未知品种的鉴别。
值得注意的是，该标准不适用于实质性派生品种(essential derived varieties, EDV)的鉴定14。实质性派生品种是指通过突变、回交、转基因等方法从原始品种派生出的新品种，这类品种的鉴定需要更精细的分子标记技术。
术语与定义
标准中定义了多个关键术语，为技术实施提供了统一的概念基础：
品种真实性验证(variety verification)：与其对应品种名称的标准样品比较，检测证实供检样品品种名称与标注是否相符。本标准中指品种间在DNA分子标记带型上的一致性。
品种真实性身份鉴定(variety identification)：通过与标准样品DNA指纹数据库比对或筛查，确定送验样品的真实品种名称。
标准样品(standard sample)：国家指定机构保存的具有法定身份的代表品种特征特性的实物种子或DNA样品。
参照样品(reference sample)：携带SSR位点上主要等位变异的品种，用于辅助确定试验样品的等位变异，校正仪器设备的系统误差。
引物组合(primer panel)：具有不同荧光颜色或相同荧光颜色而扩增片段大小不同、能够组合在一起进行电泳的一组荧光标记引物。
SSR分子标记(simple sequence repeat marker)：由几个核苷酸(一般为2-6个)为重复单元的多达几十至几百次的串联重复；由于基本单元重复次数的不同，进而形成SSR座位的多态性；根据SSR座位两侧保守的单拷贝序列设计一对特异引物来扩增SSR序列，即可揭示其多态性。
这些术语的定义为标准的正确理解和实施奠定了基础，确保了不同实验室间检测结果的可比性和一致性。
技术原理与检测方案
NY/T 2634-2022标准基于SSR分子标记技术，建立了完整的棉花品种真实性鉴定体系。该部分将详细介绍标准的技术原理、检测方案设计以及关键引物信息。
技术原理
SSR(简单重复序列)分子标记技术是本标准的核心，其原理基于棉花不同品种基因组中简单重复序列的重复次数差异。这些差异具有世代稳定遗传的特性，可以作为品种鉴别的分子指纹。
具体技术路线包括：
从代表性样品中提取DNA
使用SSR引物进行PCR扩增
通过电泳检测扩增片段大小差异
比较样品间的带型模式，判断品种真实性
标准特别指出，对于四倍体棉花，新开发的CCRI-SSR标记组合实现了"二倍化分型"，有效解决了四倍体棉花基因组复杂带来的技术难题3。此外，标准采用了四色荧光10重PCR检测技术，使检测效率提高了10倍以上。
检测方案设计
标准提出了"适于检测目的"的原则，要求根据不同的检测需求和实验室条件，选择合适的检测方案9。检测方案的选择主要考虑以下因素：
检测平台选择：对于品种真实性验证：可采用变性PAGE垂直板电泳或毛细管电泳，宜在同一电泳板上比较试验样品和标准样品
对于真实性身份鉴定：宜采用毛细管电泳，便于与DNA指纹数据库比对
高通量检测：
对于样品数量较大的情况，可将组织研磨仪、DNA自动提取、自动移液工作站、高通量PCR扩增仪、多引物组合的毛细管电泳进行组合，提高检测效率
技术调整空间：
在确保检测质量的前提下，允许对DNA提取、PCR扩增和电泳的技术条件做适宜调整，以适应不同检测平台的要求
核心引物组合
标准遴选了60对SSR引物作为品种真实性验证和身份鉴定的检测引物9。这些引物具有以下特点：
全基因组分布，覆盖棉花所有染色体
具有高质量和单拷贝特性
退火温度统一，便于多重PCR
荧光标记，适合毛细管电泳检测
表：部分SSR引物信息示例9
编号 引物名称 染色体位置 退火温度(℃) 引物序列(5'-3')
1 PCCCRI01 A01 60 F:CCACCAGCCTTACCTTATACGC
R:GTGCTTGGCCCTCGCTAAGT
2 PCCCRI02 A02 60 F:AGTCTCCCACTATTCGAAGCT
R:ATGCCTCGTACCCTGTTCCG
3 PCCCRI03 A03 60 F:CACGACGACTCTTCCTCATCAC
R:ATTGCAGCCACGAAATTGTCA
这些引物经过了大量测试和指纹大数据统计分析，确定了不同棉花育成品种差异位点的合理判定阈值，确保了检测结果的准确性和可靠性。
表注：F表示正向引物，R表示反向引物
检测程序与操作方法
NY/T 2634-2022标准详细规定了棉花品种真实性鉴定的完整操作流程，包括样品制备、DNA提取、PCR扩增、电泳检测等关键步骤。以下将对这些技术环节进行系统阐述。
样品制备与要求
标准对检测样品提出了明确要求：
样品类型：受检样品和标准样品可为棉花的种子、幼苗或幼嫩叶片等组织。
样品质量：
样品纯度应符合GB4407.1《经济作物种子纤维类》的规定
种子扦样按GB/T 3543.2《农作物种子检验规程扦样》执行
种子发芽按GB/T 3543.4《农作物种子检验规程发芽试验》执行
对照设置：以受检样品所标注品种的标准样品作为对照，同时检测受检样品和标准样品。
取样数量：从受检样品和标准样品中随机抽取12粒种子或单株进行检测，以保证结果的代表性。
DNA提取方法
标准采用CTAB法分单株(或单粒种子)提取基因组DNA，具体步骤如下：
样品处理：
取单粒种子，剥壳并将种仁磨碎，移入2.0mL离心管
或取棉花幼嫩叶片约200-300mg，加液氮充分研磨
初步提取：
加入1mL 4℃预冷的DNA抽提液和2μL β-巯基乙醇，混匀后4℃静置5min
12000r/min离心10min，弃上清
裂解处理：
加入1mL 65℃预热的DNA裂解液和2μL β-巯基乙醇，混匀
65℃水浴30min，12000r/min离心10min
纯化步骤：上清液转移至新管，加等体积苯酚+氯仿+异戊醇(25:24:1)混合液，混匀离心
上清液再次转移，加等体积氯仿+异戊醇(24:1)混合液，混匀离心
DNA沉淀：
吸取上清液，加等体积异丙醇，混匀，-20℃放置30min以上
5000r/min，4℃离心5min，弃上清
沉淀经70%乙醇洗涤后，室温晾干
加入100μL水溶解DNA6
对于高通量检测，标准允许使用组织研磨仪和DNA自动提取系统，以提高效率9。
PCR扩增体系与条件
标准对PCR反应体系进行了优化，具体包括：
反应体系（以20μL体系为例）：
10×PCR缓冲液 2μL
25mmol/L MgCl₂溶液 1.2μL
2.5mmol/L dNTPs混合液 1.6μL
10μmol/L SSR引物工作液 各0.4μL
Taq DNA聚合酶 1U
模板DNA 20-50ng
加水至20μL6
扩增程序：
94℃预变性5min
94℃变性30s，适当退火温度(通常60℃)30s，72℃延伸30s，共35个循环
72℃最终延伸10min
4℃保存
标准特别指出，对于多重PCR，需要根据引物组合调整退火温度和循环参数9。新标准中采用的四色荧光10重PCR技术大大提高了检测通量。
电泳检测方法
根据检测平台不同，标准提供了两种电泳检测方案：
变性PAGE垂直板电泳：
制备6%变性聚丙烯酰胺凝胶
取PCR产物与加样缓冲液混合，95℃变性5min，立即冰浴
上样电泳，恒定功率下电泳至指示剂迁移适当距离
银染显色：固定→染色→显影→终止
毛细管电泳：
更适合高通量检测和多重PCR产物分析
需要荧光标记引物和内标
使用遗传分析仪检测，软件自动分析片段大小
标准建议，对于品种真实性验证，可采用PAGE或毛细管电泳；对于真实性身份鉴定，宜采用毛细管电泳，便于与数据库比对。
结果分析与判定标准
NY/T 2634-2022标准对棉花品种真实性鉴定的结果分析和判定提出了明确要求，包括数据记录、差异位点判定、鉴定意见和结果报告等方面，确保检测结果的科学性和可靠性。
数据记录与分析
带型记录：
对于PAGE电泳，直接观察记录各单株的带型模式
对于毛细管电泳，记录每个SSR位点的等位变异片段大小(以bp为单位)
差异位点判定：
将受检样品与标准样品就单株间的带型逐一进行比较
记录存在差异的SSR位点数量和具体差异
数据库比对：
对于身份鉴定，需将样品指纹数据与标准样品DNA指纹数据库比对
中国农业科学院棉花研究所已构建了涵盖近二十年1600余份棉花审定品种与新品种保护标准样品的DNA指纹数据库
判定标准与阈值
标准根据检测目的不同，制定了相应的判定规则：
品种真实性验证：
依据SSR位点差异数目进行判定
具体差异阈值标准中应有明确规定(由于搜索结果未提供具体数值，实际应用需参考标准全文)
品种真实性身份鉴定：
依据"被检SSR位点无差异"原则进行筛查
只有当样品与数据库中某一品种在所有检测位点上均无差异时，才能判定为该品种
实质性派生品种(EDV)：
明确说明本标准不适用于EDV鉴定
EDV鉴定需要更精细的分子标记和分析方法
鉴定意见与结果报告
新标准增加了"鉴定意见"和"结果报告"章节，规范了结果表述和报告格式：
鉴定意见内容：
检测样品信息
使用的SSR引物信息
检测平台和方法
结果分析与判定
检测结论
结果报告要求：
注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息
包括但不限于：引物组合、检测平台、样品状况等
对于与标准样品存在差异的情况，应报告差异位点数量和具体差异6
报告格式：
标准可能提供了统一的报告模板
至少应包括检测机构信息、样品信息、检测方法、结果、结论、检测日期和责任人等要素
标准强调，检验报告应如实反映检测过程和结果，确保可追溯性和可重复性9。对于复杂的检测结果，应提供必要的解释和说明，避免误导。
标准附录与支持文件
NY/T 2634-2022标准包含了多个附录和配套文件，为标准的实施提供了详细的技术支持和参考资料。这些附录内容对于实验室正确理解和执行标准至关重要。
主要附录内容
标准包含以下四个资料性附录：
附录A：溶液配制
详细列出了检测过程中所需各种溶液的配制方法，包括：
DNA抽提液和裂解液的配方
电泳缓冲液(如5×TBE)的配制
聚丙烯酰胺凝胶溶液的配制
染色液和显影液的配制方法等
附录B：等位变异扩增片段信息
提供了核心SSR标记的等位变异片段大小信息，包括：
每个SSR位点可能出现的等位变异范围
片段大小参考值(以bp为单位)
不同品种在这些位点的特征性带型79
附录C：60对SSR引物四色荧光分组方案
针对毛细管电泳平台，提供了：
60对SSR引物的荧光标记方案
多重PCR的分组建议
各引物组的扩增片段大小范围
退火温度等关键参数
附录D：参照样品名单
列出了用于辅助确定试验样品等位变异、校正系统误差的参照样品，包括：
参照样品的品种名称
在各SSR位点的特征带型
样品来源信息等
配套专著与数据库
为支持标准的实施，起草单位还开发了相关配套资源：
《国家审定棉花品种SSR指纹图谱》专著
基于本标准方法编辑出版，提供了：
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典型带型
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